PCR技术简史

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PCR技术简史

点击次数：1524 发布时间：2008-5-22

?一滴残留在裙子上的精液使得美国总统Bill Clinton不得不坦承他与白宫实习生有不正当的关系。因为他知道现在的生物科技就连一个精子也能被用来做为证据。这种将极微量的生物标本化为可供鉴定的现代技术正是PCR(Polymerase chain reaction--聚合酶链式反应)具有的特色之一。这也是分子生物医学令人震撼的一例。
??? 何谓PCR 简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内 In Vitro 的大量合成。基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。
????PCR的要素? 基本的PCR须具备１.要被复制的DNA模板 Template ２.界定复制范围两端的引物Primers. ３.DNA聚合酶 Taq. Polymearse 4.合成的原料及水。PCR的反应包括三个主要步骤，分别是1. Denaturation 2. Annealing of primers,3. Extension of primers。所谓 Denaturing乃是将DNA加热变性，将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板. 而Annealing 则是令 Primers于一定的温度下附着于模板DNA两端。最后在DNA聚合酶 e.g. Taq-polymerase 的作用下进行引物的延长 Extension of primers及另一股的合成。
??? PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研
究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与
合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因"。
　　PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义
的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一
种合适的条件---摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及
延伸的温度与时间。
　　PCR的改进与完善　Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片
段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温， 90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延
伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的
DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，
但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成
一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引
起生物医学界的足够重视。
　　1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较
高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。
　　1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌thermus aquaticus 中提取到一种
耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的
90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40
%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异
性和扩增效率，增加了扩增长度2.0Kb。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也
大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶Taq DNA
Polymerase。此酶的发现使PCR广泛的被应用。
??? 获得诺贝尔奖的PCR技术
??? 1995年，美国科学家Mulis众望所归地获得了诺贝尔化学奖，他所取得的成就是发明了PCR技术。
　　PCR，中文译为聚合酶链式反应，其实是一种DNA的快速扩增技术，其扩增效率之高就象核裂变的“链式反应"那样。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热的酶的作用，可以在3个小时内把特定的DNA量提高1000万倍。这种技术一问世，立刻引起了分子生物学研究的一场革命，人们利用这种轰动全世界的技术很快就把微观领域的生物学研究大大地往前推了一步。可以这么说，PCR技术使分子生物学研究一下子获得了突破，而且随着PCR技术的日趋完善，PCR在人类社会生活中的应用也越来越广泛。比如说在“DNA指纹"中我们提到，科学家们只需要一根头发甚至一个细胞就可以完成DNA指纹的鉴定工作，这里实际上就要采用PCR技术，因为一个细胞中的DNA含量实在太少了，人们根本不可能检测到它的指纹；有了PCR技术就好办了，通过PCR技术把这个细胞中的DNA片断扩增1000万倍，这样DNA量就足够作指纹鉴定了。再比如，在医院里检验血液中的某种病毒，有时病毒量极少(例如有的艾滋病病毒携带者)，通过传统的检查方法费力又费时，这时PCR技术也许就可以帮上忙。可以先选定这种病毒DNA上的一段DNA，设计合适的引物DNA，然后通过PCR技术一扩增很快就可以判断出血样中是否扩增出了大量的DNA，如果是的话，那么就说明血样中带有该种病毒了。PCR方法不但有极高的灵敏度，而且可以同时一次做近百个扩增反应，省时省力效率高。
　　PCR技术神奇就神奇在以下几个特点上：一是被扩增的DNA所需量极小，理论上讲一个分子就可以用于扩增了；二是扩增效率高，几个小时就扩增1000万倍以上。现在PCR技术已经被广泛地应用于生命科学研究、食品卫生、医疗、法医及环境监测等诸多方面，真不愧是“获得诺贝尔奖"的好技术！

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